BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar belakang

            Di zaman yang modern seperti sekarang ini, perkembangan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi melaju dengan pesatnya. Tuntutan kebutuhan hiduplah yang menjadikan manusia giat mengembangkan ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai ilmu dikembangkan, mulai dari ilmu sosial hingga ilmu eksak. Seperti salah satu ilmu eksak yaitu ilmu kimia. Dalam praktiknya secara umum ilmu kimia, yaitu ilmu yang mempelajari tentang sususnan, sifat, dan reaksi suatu unsur atau zat dalam berbagai jenis  benda material.

            Dalam ilmu kimia banyak aspek-aspek penelitian yang dilakukan. Seperti halnya, yang paling spesifik yaitu pemisahan molekul- molekul dari senyawa zat nya, atau yang disebut dalam ilmu kimia yaitu Kromatografi. Kromatografi terbagi menjadi berbagai macam lagi. Pada kesempatan kali ini penulis akan membahas tentang “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” atau yang biasa di kenal HPLC. Bahasan ini akan penulis rangkum dalam bentuk makalah.

1.2  Tujuan

            Dalam penulisan makalah ini, penulis bertujuan untuk :

a.      Memenuhi nilai salah satu tugas mata pelajaran kimia instrument.

b.      Bahan referensi pada saat pembelajaran kimia instrument

c.       Bahan pembelajaran dalam pembuatan makalah

1.3  Metodologi

            Dalam pembuatan makalah ini, penulis menggunakan metode :

a.      mencari referensi dari buku sumber kimia

b.      mencari referensi dari Internet

1.4  Sistematika 

I.        Pendahuluan

II.      Isi pembahasan

III.    Penutup

IV.    Daftar pustaka

1.5  Ruang lingkup

            Kromatografi terdiri dari berbagai jenis, yaitu :

a.      kromatografi kolom

b.      kromatografi kertas dan lapis tipis

c.       kromatografi gas

d.      kromatografi HPLC

            Dalam makalah ini penulis akan membahas kromatografi cair kinerja tinggi dan alat yang digunakan yaitu HPLC.  HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

BAB II

ISI

2.1  Pengertian HPLC

                HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
            HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.

            Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol.

            HPLC ini digunakan untuk asam organik , seperti asam formiat dan asam asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus  bening.

2.2  Prinsip kerja alat HPLC

Prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

2.3  Jenis-jenis HPLC

·         Berdasarkan prinsip kerjanya :

1.      HPLC Isocratic

HPLC isocratic digunakan pada analisis senyawa kimia yang tidak memerlukan perubahan komposisi fasa gerak, suhu, tekanan (preassure) dan daya alir (flow) selama sampel diinjeksikan dan terelusi di dalam kolom.

2.      HPLC Gradient

HPLC gradient digunakan pada analisis senyawa kimia yang biasanya memerlukan perubahan komposisi fasa gerak, suhu, preassure dan flow selama sampel terelusi di dalam kolom agar senyawa kimia tersebut dapat dipisahkan dari campurannya secara sempurna.

·         Berdasarkan berdasarkan sifat kepolaran (polarity) dari fase diam dan fase geraknya :

1. Kromatografi fasa normal (normal phase) adalah kromatografi yang    dilakukan    dimana fase diam lebih polar dibandingkan fase geraknya.

2. kromatografi fase terbalik (reversed phase) balik  adalah kromatografi dengan fase gerak lebih polar dibandingkan fase diamnya.

2.4  Cara menggunakan HPLC

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.

Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu biasanya H₂SO₄ 0,05 N dan CH₃OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.

Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.

            Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek  dari Elusi Gradien adalah  mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang  tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.

           

            Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a.  Total waktu analisis dapat direduksi

b.  Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c.  Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d.  Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

            Gradien dapat dihentikan sejenak atau  dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error.

            Gradien elusi memisahkan analit bergantung pada afinitas elektron sesuai fungsi dari afinitas elektron analit sebagai fase bergerak relatif terhadap fase diam. Hal ini sesuai dengan ekstraksi liquid-liquid, namun berjalan secara kontinu. Sesuai dengan prinsip tersebut maka komponen yang hidrofob dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol tinggi, sedangkan komponen yang hidrofil dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol rendah.

            Setelah itu sampel dikeluarkan dari HPLC dan ruangan pembuangan dari HPLC ini dicuci dengan asam asetat.

2.5  Keuntungan dan Kerugian HPLC

2.5.1                    Keuntungan HPLC

            Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

·      Lebih teliti

·      Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

·      mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

·      mudah melaksanakannya

·      kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

·      dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

·      Resolusi yang baik

·      dapat digunakan bermacam-macam detektor

·      Kolom dapat digunakan kembali

·      mudah melakukan "sample recovery"

Keuntungan utama KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG).  Dalam banyak  hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi  dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama.

Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan  KG, tetapi akan memainkan peranan  yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi  juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain:

·         Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam.  Banyak analisis yang dapat diselesaikan  sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai

·         Resolusi  : Berbeda dengan  KG, Kromatografi Cair mempunyai dua fasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG,  gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;  pemisahan terutama dicapai  hanya dengan fasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk  mencapai pemisahan yang diinginkan.

·         Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah  nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT 

·         Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal untuk zat  bermolekul  besar dan  berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan  KG karena volatilitas  rendah  , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies  ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion  ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

·         Mudah rekoveri sampel : Umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada  komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen  sampel tersebut  dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan kecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

2.5.2                    Kerugian HPLC

            Kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

·         Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

·         Hanya bisa digunakan untuk asam organik

·         Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi

·         Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

2.6  Hal-hal yang harus diperhatikan dalam HPLC

            Diameter internal dari kolom HPLC adalah aspek penting yang menentukan kapasitas analit yang dapat dimasukkan dan dapat mempengaruhi sensitivitas. Kolom yang lebih lebar dijumpai di aplikasi industri seperti pemurnian obat-obatan, sedangkan kolom yang lebih sempit menaikkan sensitivitas dan hanya membutuhkan sedikit solven.

            Ukuran partikel juga berpengaruh. HPLC tradisional kebanyakan fase diamnya melekat pada partikel silika. Ukuran partikel yang paling umum adalah 5μm. Ukuran yang lebih kecil menyediakan luas area lebih besar dan separasi yang lebih baik, namun tekanan yang dibutuhkan untuk kecepatan linear optimum berbanding terbalik dengan kuadrat diameter partikel.

Tekanan pompa yang besar dibutuhkan untuk partikel yang sangat kecil, dan sekarang ada UHPLC (Ultra HPLC) yang dapat bekerja pada tekanan sangat tinggi (1000 atm).

            Kolom (coloum) yang digunakan pada HPLC untuk pemisahan biasanya mempunyai porositas yang sangat kecil (3-50 µm) dengan diameter dalam 2-5 mm, sehingga seluruh fase  gerak serta sampel yang dianalisis harus disaring menggunakan saringan mikro dengan filter yang mempunyai ukuran yang lebih kecil atau sama dengan porositas dari kolom yang akan digunakan. Biasanya jika menggunakan kolom dengan ukuran porositas 10 µm, maka fase gerak dan sampel harus disaring dengan filter ± 0,45 µm. Hal tersebut sangat penting untuk memperoleh hasil pemisahan yang sempurna serta untuk menghindari terjadinya penyumbatan (blocking) di dalam kolom sehingga self life kolom lebih panjang. Panjang pendek kolom juga mempengaruhi kecepatan dari terpisahnya masing-masing analit.

            Kolom dapat dipanaskan agar dihasilkan pemisahan yang lebih efesien, akan tetapi suhu di atas 60^o  jarang digunakan, oleh karena mungkin terjadi penguraian fase diam ataupun penguapan fase gerak pada suhu yang lebih tinggi tersebut. Jika tidak dinyatakan lain dalam monografi, kolom dipertahankan pada suhu kamar.

Teknologi kolom partikel kecil ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak pada tekanan tinggi, agar tercapai laju aliran beberapa ml per menit. Oleh karena sering digunakan jumlah zat uji yang kecil (umumnya lebih kecil dari 20 µg), maka diperlukan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini, maka kromatografi cair dalam banyak hal dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat dan efisien yang tinggi.

            Kolom yang terdapat pada alat, HPLC merupakan fase diam dimana senyawa kimia yang berbeda akan berinteraksi berdasarkan perbedaan afinitasnya. Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

            Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT,  tetapi ada  beberapa sifat umum  yang disukai, yaitu fasa gerak harus :

·         Murni, tidak terdapat kontaminan

·         Tidak bereaksi dengan wadah (packing)

·         Sesuai dengan defektor

·         Melarutkan sampel

·         Memiliki viskositas rendah

·         Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

·         Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

            Umumnya, semua solven yang sudah  digunakan langsung dibuang karena prosedur pemurniannya kembali  sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1 s/d 4) merupakan yang sangat penting.           Menghilangkan gas (gelembung udara)  dari solven, terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan  yang besar di  dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom  yang sensitif terhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2).

2.6.1        Fase normal HPLC

Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm yang diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

2.6.2        Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.
Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC untuk melihat seluruh proses    

2.7 Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

                Injeksi sample seluruhnya bekerja secara otomatis sehingga kita tidak mungkin mengetahui apa yang terjadi selama prose situ berlangsung, karena proses ini meliputi tekanan.

Waktu retensi

            Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum, dari senyawa itu.

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

• tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
• kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
• komposisi yang tepat dari pelarut
• temperatur pada kolom

            Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika kita menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor

            Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

            Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, kita akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

            Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati berkas pada waktu itu. Kita akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya, tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

            Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika kita menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, kita sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

            Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang kita mengontrol kondisi kolom, kita dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.Tentunya, kita sudah mengukur senyawa-senyawa murni tersebut dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

            Kita juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa kita tertarik dengan senyawa tertentu, misalnya X.

            Jika kita menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, kita tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi kita juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

            Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
            Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama.

            Misalnya,Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahui berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

           

            Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika kita mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah kita mengatakan jumlah relatifnya? kita tidak dapat mengatakannya jika kita menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

                    Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi bisa jadi sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin karena jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah,ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

2.8  Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.

           Bagian-bagian instrument HPLC

Keterangan :

1.       Botol pelarut (reservoir)

                Botol untuk fase gerak (mobile phase) dapat berisi campuran eluen atau eluen murni disesuaikan dengan kepentingan analisa.

2.       Pompa (pump)

            Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC memiliki keluaran tekanan (output pressure) 1000-6000 psi dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mL/menit.

            Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan  (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa  reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam  elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

3.       Injektor (injector)

            Injektor adalah tempat untuk menyuntikan sampel ke dalam kolom. Sampel yang akan dimasukkan  ke bagian  ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom.

            Ada dua model umum :

a.      Stopped Flow

b.      Solvent Flowing

            Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

1)      Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

2)      Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak  tahan  dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari  septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

3)      Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10  µ dan dilakukan dengan cara  automatis  (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada  posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.

4.      Kolom (coloum)

            Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge, ada pula yang terbuat dari stainless steel. Kolom terdiri dari fase diam (oktil, oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang terikat secara kimia dengan partikel-partikel silika berpori yang terdapat dibagian dalam kolom.

            Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.

            Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1)      Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2)      Kolom preparatif: umumnya memiliki  diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk  kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung  pada model KCKT  yang digunakan (Liquid Solid Chromatography,  LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion  Exchange Chromatography,  IEC, Exclution Chromatography, EC)

5.      Detektor (detector)

            Detektor yang paling banyak digunakan adalah detector ultra violet (UV)/Visible, fluorometer (terutama untuk zat yang memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi) dan detektor indeks bias.

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan  fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.  Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan  untuk mendeteksi banyak  senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang  sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.

            Detektor-detektor lainnya antara lain:

1)      Detektor Fluorometer    

2)      Detektor Spektrofotometer Massa

3)      Detektor lonisasi nyala    

4)      Detektor Refraksi lndeks

5)      Detektor Elektrokimia    

6)      Detektor Reaksi Kimia

6.      Komputer (PC) dan Printer

            Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan disebut kromatogram.

2.9  Komponen Analisis HPLC

            HPLC memiliki empat komponen dasar: sistem pengiriman pelarut untuk memberikan kekuatan pendorong untuk fase gerak, sebuah sarana yang sampel dapat diperkenalkan ke dalam pelarut, kolom, dan beberapa jenis detektor. Sebuah perekam digunakan untuk menampilkan hasil dan integrator yang melakukan perhitungan.

            Kolom yang digunakan untuk pemisahan tertentu didasarkan pada jenis molekul yang akan dianalisis. Berbagai jenis mode kromatografi dapat digunakan untuk pemisahan molekul. Sebagai contoh, kolom pertukaran ion terpisah dibebankan molekul seperti asam amino, protein, atau nukleotida. Ukuran polimer organik pengecualian kolom terpisah seperti polyvinyls dan silikon atau biopolimer seperti protein, asam nukleat, atau gula. Adsorpsi molekul kolom terpisah berdasarkan interaksi mereka dengan fase diam. Mode ini berguna untuk pemisahan vitamin, pewarna, lipid, fenol, dan antioksidan. 

            Pemisahan kolom digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan cara bahwa pelarut menjadi dibagi menjadi lapisan stasioner dan mobile, dan berguna dalam menganalisis steroid, aromatik, vitamin, dan antibiotik. 

            Molekul-molekul eluting dari salah satu dari berbagai jenis kolom ini kemudian dianalisis oleh berbagai jenis detektor, mengukur absorbansi, fluoresensi, atau elektrokimia atau properti radiokimia. Jenis lain dari detektor termasuk indeks massa spektroskopi dan bias.

2.10          Aplikasi HPLC

            Sebuah kemajuan terbaru dari HPLC telah pengembangan metode HPLC dipisahkan oleh medan (DHPLC). prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda dengan sebagai sedikit sebagai salah satu pasangan basa. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekular.

             Aplikasi dari DHPLC termasuk deteksi polimorfisme nukleotida tunggal (SNP). Ini adalah satu variasi pasangan basa dalam DNA yang dapat memberikan informasi yang berharga pada variasi genetik dalam populasi. Mereka juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu.

            Untuk menentukan apakah kedua gen kepentingan berbeda, mereka terlebih diperkuat oleh reaksi berantai polimerase dan kemudian disuntikkan bersama-sama ke dalam kolom terbalik-fase yang disebut. Dalam jenis kolom, fasa stasioner kurang polar dari fase gerak, yang merupakan kebalikan dari pengaturan yang ditemukan di kolom standar. Setelah gen yang disuntikkan, yang mengikat DNA pada fase stasioner. Peningkatan suhu menyebabkan gen masing-masing untuk memisahkan menjadi dua alur (fenomena yang disebut dipisahkan oleh medan). Setelah didenaturasi, alur dapat memasuki fase gerak dan bergerak melalui kolom.

            Pendinginan kolom menyebabkan untai gen untuk bergabung, dan DNA pasang kembali ke kolom. Suhu dimanipulasi untuk membuat untaian terus terpisah dan bergabung kembali, dengan saldo ditentukan oleh kekuatan daya tarik yang ada antara untai. Jika dua gen yang persis sama, mereka akan menghabiskan lebih banyak waktu dalam fase stasioner, dan elute dari kolom lebih lambat. Jika gen berbeda bahkan oleh nukleotida tunggal, bagaimanapun, mereka akan menghabiskan lebih banyak waktu dalam fase gerak, dan biarkan kolom lebih cepat.

analisis kromosom Y adalah salah satu alat molekul yang paling kuat untuk melacak evolusi manusia. 

            Polimorfisme dalam kromosom Y manusia, terdeteksi oleh DHPLC, dapat digunakan sebagai penanda untuk melacak evolusi manusia. Hal ini pada akhirnya akan membantu untuk menjelaskan pola-pola asal-usul manusia, migrasi, dan campuran. Kemampuan untuk secara cepat dan efisien SNP genotipe dengan menggunakan DHPLC juga berguna dalam kedokteran, melalui identifikasi mutasi yang mengakibatkan kerentanan terhadap penyakit tertentu atau yang mempengaruhi tanggapan fisik terhadap obat tertentu.

BAB III

KESIMPULAN

1.      HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.

2.      Prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggungakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

3.      Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

·         Lebih teliti

·         Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

·         mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

·         mudah melaksanakannya

·         kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

·         dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

·         Resolusi yang baik

·         dapat digunakan bermacam-macam detektor

·         Kolom dapat digunakan kembali

·         mudah melakukan "sample recovery"

4.      Kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

·         Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

·         Hanya bisa digunakan untuk asam organic

·         Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi.

·         Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

DAFTAR PUSTAKA

Basset,J.dkk.1994.Buku Ajar Vogel Analisis Kunatitatif Anorganik.

Jakarta: E.G.C.Penerbit Buku Kedokteran

Depkes RI Farmakope Indonesia,halaman 1061-1064

Cook Book.Atomatik Absorption Spectrometer Al 1200 ,buku satu.

http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/

Bidlingmeyer, Praktis HPLC Brian A. Metodologi dan Aplikasi: New. York John Wiley & Sons, 1992.

Underhill, A. Peter, Peidong Shen, Alice A. Lin, et al. "Kromosom Y Sequence Variasi dan Sejarah Manusia Genetika populasi. Sifat" 26 (2000): 358-361.

Gemboa Ana,2003, The Theory and Instrumentation of the AAS , www.physicspost.com/articles.php

http://www.cee.vt.edu/ewr/environmental/teach/smprimer/aa/aa.html.         

http://infolab.uns.ac.id/?p=875

http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en|id&u=http://www.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/HPLCMYTRY.html

http://www.lcresources.com/resources/getstart/generic%20HPLC.gif            

http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en|id&u=http://www.encyclopedia.com/doc/1G2-3406500142.html